Vol. 2° -  XVII.4.2.

Struttura del genoma mitocondriale

I mitocondri, che sono organuli presenti nel citoplasma di tutte le cellule degli animali aerobi e dei vegetali, rappresentano le strutture cellulari deputate a fornire la maggior parte dell’energia. I mitocondri contengono gli enzimi del ciclo di Krebs, svolgono la fosforilazione ossidativa e sono coinvolti nella biosintesi degli acidi grassi. La presenza di DNA nei mitocondri è stata dimostrata con diverse tecniche, tra le quali la microscopia elettronica, l’autoradiografia e l’isolamento dai mitocondri di tipi di DNA con densità di galleggiamento diversa da quella del DNA nucleare.

Il DNA mitocondriale è un cromosoma circolare superavvolto a doppia elica, privo di istoni, e quindi non organizzato in nucleosomi. Le dimensioni del cromosoma variano da organismo a organismo, ma sono costanti all’interno delle specie. È interessante osservare che i cromosomi mitocondriali degli animali superiori sono decisamente più piccoli di quelli dei funghi o dei vegetali in genere. Il cromosoma mitocondriale umano, ad esempio, è pari a 16.569 bp, quello del pollo è costituito da 16.775 coppie di basi, mentre quello di Drosophila è circa 18.000 bp, quello di Neurospora crassa è di circa 60.000 bp e quello di lievito di circa 75.000 bp. I genomi mitocondriali delle piante sono ancora più grandi e sono compresi tra 250.000 e 2 milioni di bp (80÷800 mm), a seconda delle specie. Il genoma mitocondriale del mais è pari a circa 600.000 bp (200 mm).

Fig. XVII. 1 – Molecola di DNA circolare da mitocondri di cellule epatiche di pollo: 16.775 bp.

Nonostante le differenti dimensioni, i mitocondri di tutti gli organismi contengono la stessa quantità di DNA a singola copia, cioè quel DNA che codifica per prodotti funzionali mitocondriali. Quindi, nonostante la disparità nelle dimensioni del genoma, l’unica differenza tra mitocondri animali, vegetali e degli altri organismi risiede nel fatto che quasi tutto il genoma dei mitocondri animali è codificante, mentre il genoma mitocondriale di funghi e piante, oltre al DNA codificante, contiene una gran quantità di DNA che non codifica per alcun prodotto genico.

Il contenuto informativo del genoma mitocondriale è molto piccolo se raffrontato a quello nucleare, mentre la quantità relativa di DNA è piuttosto grande. Nei mitocondri ci sono regioni nucleoidi, simili a quelle dei batteri, ciascuna delle quali contiene numerose copie di genoma mitocondriale. Il lievito, per esempio, ha 4-5 molecole di mtDNA per nucleoide, e ogni mitocondrio possiede da 10 a 30 nucleoidi. Poiché ogni cellula di lievito possiede da 1 a 45 mitocondri, in ogni cellula sono presenti parecchie molecole di mtDNA. Per questa molteplicità, il contributo mitocondriale alle attività dell’intera cellula può essere significativo.

4.2.a. Replicazione dell’mtDNA

La replicazione dell’mtDNA avviene per opera delle DNA polimerasi mitocondriali, che funzionano in modo indipendente dalle DNA polimerasi nucleari. Come avviene nella replicazione del DNA nucleare, per l’inizio della replicazione vengono sintetizzati degli RNA che fungono da innesco. Il processo di replicazione del DNA mitocondriale si verifica durante tutto il ciclo cellulare, senza nessuna preferenza per la fase S durante la quale viene replicato il DNA nucleare. Ci sono alcune differenze nella replicazione del DNA mitocondriale nei diversi eucarioti, ma il modello dello spostamento dell’ansa (loop displacement, o D loop), dedotto dall’osservazione dei mitocondri animali in vivo, è uno schema generale utile in tutti i casi.

Nella maggior parte degli animali, le due eliche dell’mtDNA hanno una densità diversa: H, heavy, pesante, e l’altra L, light, leggera. Il modello di replicazione a D loop mostra una relativa asincronia nella replicazione delle due eliche complementari H e L. Nel modello a D loop, la sintesi di una nuova elica H incomincia in un punto di origine, l’origine dell’elica L, e forma una struttura ad ansa a forma di lettera D, visibile al microscopio elettronico. Dopo che la nuova elica H si è allungata, prosegue la sua sintesi, e inizia la sintesi della nuova elica L in un secondo punto d’origine (il punto di origine dell’elica H). Entrambe le eliche vengono completate per sintesi continua. Infine i DNA circolari vengono convertiti nella forma superavvolta, che presenta circa cento avvolgimenti.

Prove sperimentali indicano che i mitocondri e i cloroplasti crescono e si dividono, e non derivano dall’assemblaggio di componenti singole. L’esperimento classico per dimostrare la modalità di replicazione di un mitocondrio completo, venne eseguito nel 1963 da David Luck in Neurospora crassa utilizzando radioisotopi che conferiscono una densità diversa. Quest’esperimento è simile a quello condotto da Meselson e Stahl per dimostrare che la replicazione del DNA è semiconservativa. Luck fece crescere la Neurospora su un terreno contenente proteine leggere e un precursore dei lipidi, la colina, di elevata densità.

In queste condizioni, i mitocondri prodotti erano più densi dei mitocondri trovati nelle cellule di Neurospora cresciute su un terreno di coltura normale. Successivamente Luck trasferì le cellule di Neurospora su un terreno di crescita con proteine pesanti e col precursore dei lipidi leggero. Esaminò quindi la densità dei mitocondri dopo una generazione. Si potevano attendere due risultati: se i mitocondri fossero cresciuti e si fossero divisi, allora tutta la progenie avrebbe contenuto metà del materiale sintetizzato in terreno con precursori a bassa densità e metà del materiale sintetizzato su terreno ad alta densità. Questi mitocondri avrebbero avuto una densità intermedia tra i mitocondri leggeri e quelli pesanti. Se invece i mitocondri venissero costruiti ex novo, allora ci sarebbero stati due tipi di mitocondri: quelli ad alta densità, nati all’inizio dell’esperimento, e quelli a bassa densità, nati dopo il trasferimento delle cellule nel terreno con precursori leggeri. Luck osservò la presenza di mitocondri di densità intermedia, ad indicare che i mitocondri crescono e si dividono.

4.2.b. Organizzazione genica dell’mtDNA

Il DNA mitocondriale contiene l’informazione per un certo numero di componenti mitocondriali, quali tRNA, rRNA e alcune proteine. I mitocondri contengono ribosomi, responsabili della sintesi proteica che si svolge internamente al mitocondrio. Gli RNA messaggeri sintetizzati nei mitocondri rimangono nell’organulo e sono tradotti dai ribosomi mitocondriali.

Le nostre conoscenze sull’organizzazione genica dell’mtDNA derivano soprattutto da esperimenti di sequenziamento. La sequenza completa dell’mtDNA umano e di altri organismi è oggi nota. Alcune caratteristiche trovate erano inattese e potrebbero essere una caratteristica generale dell’mtDNA.

I geni che codificano per gli rRNA 16S e 12S delle subunità ribosomiali grande e piccola del mitocondrio, sono adiacenti e localizzate sull’elica H. I geni per i tRNA sono localizzati in diverse posizioni dell’elica H e L, alcuni sono raggruppati, altri sono isolati, uno dei geni si trova tra i due geni per l’rRNA.

I geni che codificano per le proteine si trovano su entrambe le eliche. La loro posizione è stata individuata in due modi, di cui il primo si è basato sulla ricerca di sequenze di DNA contenenti possibili segnali d’inizio e di terminazione in una stessa sequenza di lettura: una open reading frame, ORF, cioè una sequenza codificante, detta anche sequenza di lettura non identificata, unidentified reading frame o URF. I segnali d’inizio e di termine devono essere separati da una sequenza di una certa lunghezza e queste sequenze devono essere in grado di codificare per una serie di aminoacidi. Questa ricerca è stata facilitata dall’uso di programmi informatici di analisi, scritti appositamente a questo scopo. Il secondo metodo, usato essenzialmente da Attardi, è stato quello di allineare le sequenze 5’ e 3’ prossimali degli mRNA mitocondriali con le sequenze di DNA. Si noti che gli mRNA mitocondriali hanno la coda di poli(A), ma non il cappuccio in 5’.

I prodotti di tutte le URF del genoma mitocondriale umano sono state ora identificate e ne è stata definita la funzione. Un’analisi accurata delle sequenze geniche ha messo in luce l’esistenza di alcune differenze tra il codice genetico usato nei mitocondri e quello nucleare. Ad esempio il codone UGA, che nel codice genetico nucleare rappresenta un codone di terminazione, nel mitocondrio umano viene letto come codone per il triptofano. Altre differenze riguardano il codone ATA, che nei geni mitocondriali specifica per una metionina, mentre nel nucleo codifica per una isoleucina.

Nel codice genetico dei mitocondri umani vengono usati tutti i codoni, tranne i codoni UAA e UAG, che specificano per la terminazione della catena, funzione che esplicano anche nel codice genetico classico. Non sono stati trovati tRNA con un anticodone che riconosca le triplette AGA e AGG, quindi forse questi codoni hanno una funzione di terminazione della catena. È interessante osservare che il codice genetico dei mitocondri di lievito non è identico a quello dei mitocondri umani. Sono state osservate differenze anche nel codice genetico di alcuni protozoi ciliati. Queste differenze suggeriscono l’ipotesi che il codice genetico dei mitocondri possa essere letto in modo differente in molti eucarioti. In altre parole, il codice genetico è meno universale di quanto non sembrasse inizialmente.