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L’APPARATO per la SINTESI PROTEICA mitocondriale

4.1. Il DNA mitocondriale - mtDNA

Solo in certe condizioni sperimentali, e ricorrendo a metodiche istochimiche, si puň caratterizzare il DNA mitocondriale.

Per fare un esempio, in cellule inibite con ribonucleasi o con triidrossi-N-metilindolo durante la pre-profase mitotica, i mitocondri si colorano con la reazione di Feulgen. La desossiribonucleasi inibisce invece la reazione cromatica.

4.1.a. Morfologia dell’mtDNA

Al microscopio elettronico l’mtDNA č visibile nei mitocondri solo in condizioni eccezionali, e per metterlo in evidenza č necessario isolarlo con tecniche molto complesse. Innanzi tutto č necessario ottenere una preparazione pura di mitocondri con ultracentrifugazione e, una volta isolati, vengono sottoposti a shock ipotonico liberando per rottura il loro mtDNA che viene raccolto su un retino ricoperto da un film di carbonio. Una colorazione negativa fosfotungstica rende visibile la forma dell’mtDNA, che č circolare, costituito da un filamento chiuso lungo 5 mm. Questa struttura č presente in tutti i metazoi, dai nematodi all’Uomo. La lunghezza non č universale, in quanto nei mitocondri di Saccharomyces cerevisiae č pari a 25 mm, mentre in Neurospora crassa varia da 2 a 25 mm.

4.1.b. Numero di molecole di mtDNA

L’mtDNA rappresenta l’1¸5% del DNA cellulare totale. Nei mitocondri degli epatociti il numero medio di molecole di mtDNA per mitocondrio assomma a 4-5, che tuttavia varia in funzione dello stato fisiologico della cellula. L’mtDNA č localizzato vicino alle creste mitocondriali, alle quali č sovente adeso.

4.1.c. Replicazione dell’mtDNA

I mitocondri contengono l’enzima che interviene nella replicazione, cioč la DNA polimerasi, che assicura una modalitŕ semiconservativa. La conferma di tale meccanismo si č avuta iniettando bromodesossiuridina radioattiva ai ratti. Isolando il DNA per sedimentazione isopicnica, si puň dimostrare che č costituito da un filamento pesante, radioattivo, e da un filamento leggero, non radioattivo. Lo studio dell’incorporazione di timidina triziata nell’mtDNA di cellule epatiche umane in coltura, dimostra che l’incorporazione č continua, anche in assenza di sintesi nucleare. Il mitocondrio possiede quindi un sistema proprio di replicazione dell’mtDNA.

4.1.d. Ruolo del DNA nucleare nella sintesi dell’mtDNA

In assenza di nucleo, come nelle amebe anucleate, l’incorporazione nell’mtDNA di precursori marcati č piů rapida e di maggior entitŕ. Il nucleo avrebbe un ruolo regolatore nella replicazione mitocondriale, probabilmente tramite l’intervento di repressori. Č stato possibile studiare colture sincronizzate di Neurospora crassa : tutti i mitocondri si dividono e crescono simultaneamente. Le fasi di replicazione del DNA nucleare e di quello mitocondriale si alternano periodicamente. La sintesi di DNA mitocondriale comincia durante la fase S, raggiunge un massimo nella fase G2 e s’interrompe durante la fase M. Ciň implica l’esistenza di un sistema di controllo dell’attivitŕ mitocondriale da parte del nucleo, e il nucleo č informato dell’attivitŕ del DNA mitocondriale.