Vol. 2° -  XVIII.5.3.

Geni del pollo domestico clonati e sequenziati

Non è escluso che i geni del pollo domestico assommino a 50.000-100.000 e, a partire dal 1988, nelle banche geniche esistevano più di 350 sequenze di DNA mentre erano stati clonati più di 100 geni.

Naturalmente dobbiamo supporre che il numero di geni clonati andrà aumentando grazie ai continui perfezionamenti tecnologici. I geni sottoposti a sequenziamento appartengono alla categoria degli enzimi, degli oncogeni, dei provirus endogeni e delle proteine tissutali. Vediamone alcuni esempi.

5.3.a. Il cristallino

Nel corso dello sviluppo, per effetto di una serie di fenomeni di induzione, l’ectoderma di rivestimento prospiciente il calice ottico si invagina. Tale invaginazione ha forma di doccia aperta verso l’esterno che in seguito si chiude a formare una vescicola. La vescicola diventa peduncolata e si rende indipendente dall’epitelio d’origine per costituire l’abbozzo del cristallino, accolto nella concavità del calice ottico. Le cellule presenti al margine, o equatore dell’abbozzo, insieme a quelle della faccia posteriore, aumentano progressivamente in altezza e ne invadono la cavità, prima riducendone il lume ed infine raggiungendo l’epitelio più superficiale di tipo cubico semplice.

Al termine del differenziamento il cristallino è trasparente, ha forma di lente biconvessa e mette a fuoco le immagini sulla retina mediante variazioni del raggio di curvatura. A livello della faccia anteriore è costituito da un epitelio cubico semplice, presenta nel suo contesto le cosiddette fibre del cristallino che originano dagli elementi della faccia posteriore, ed è circoscritto dalla capsula o cristalloide.

Le fibre hanno forma di prismi esagonali e sono separate da spazi molto ridotti, pari a 15 nm; nel citoplasma, finemente granulare, si osservano rari mitocondri e piccole vescicole. I desmosomi sono sporadici, ma nelle sedi maggiormente sottoposte a deformazioni si riscontrano complicate interdigitazioni di membrane di fibre adiacenti, che si ritiene siano associate ai cambiamenti morfologici conseguenti l’accomodamento dell’immagine.

Fig. XVIII.  6 – Disposizione delle cellule in seno al cristallino

La graduale transizione fra epitelio cubico e fibre si trova in corrispondenza dell’equatore, cioè del piano frontale massimo del cristallino, e viene indicata come zona dei nuclei perché a questo livello sono ben evidenti i nuclei degli elementi cilindrici che hanno dato origine alle fibre stesse. I nuclei mancano invece nella parte centrale, a livello del cosiddetto nucleo del cristallino.

La capsula o cristalloide corrisponde alla membrana basale dell’abbozzo invaginato. È uno strato laminare omogeneo, costituito da glicoproteine e da collagene atipico, che circoscrive completamente il cristallino.

5.3.b. Cristalline

Le cristalline sono le proteine principali presenti nella lente o cristallino dell’occhio, dove rappresentano circa l’80-90% delle proteine solubili totali. Esse spiegano quasi completamente le proprietà rifrattive dell’occhio. La capacità della lente di mettere a fuoco i raggi luminosi sulla retina dipende dalla concentrazione e dalla posizione delle diverse molecole di cristalline comprese tra le fibre lenticolari, a loro volta derivate dal progressivo allungamento delle cellule epiteliali. Esistono quattro principali famiglie o tipi di cristalline, a - b - g - d, e alcune famiglie meno comuni, e - r - t.

q  Tutti i vertebrati hanno le cristalline a e b, ma la cristallina g presente nei mammiferi è sostituita negli uccelli e nei rettili dal tipo d.

q  La cristallina e è il componente maggiore delle lente dell’anatra, la r è presente nella rana, la cristallina t è stata trovata nella tartaruga e nella lampreda.

Ogni cristallina ha proprietà immunologiche diverse nonostante il sequenziamento mostri delle omologie tra la b e la g, che vengono perciò raggruppate come una superfamiglia. Esistono almeno 2 tipi di a, 7 tipi di b e g unite insieme, e 2 tipi di d.

Le ragioni per studiare le proteine della lente sono numerose, in quanto questa parte dell’occhio è quasi completamente costituita da cellule fibrose derivate da un unico tipo di cellule epiteliali. Dal momento che nella lente le cristalline sono abbondanti, gli mRNA predominanti nelle cellule epiteliali saranno quelli deputati alla sintesi delle cristalline. La struttura di queste molecole è interessante in quando spiegano l’elevata capacità rifrattiva delle cellule e non causano il fenomeno della diffusione della luce in modo apprezzabile come accade per le soluzioni proteiche concentrate. Questa necessità fisiologica ha imposto delle costrizioni alla loro evoluzione per cui sono nettamente conservate. La presenza negli uccelli della cristallina di tipo d può essere in rapporto alla loro acuità visiva che necessita di un’ampia accomodazione, che a sua volta richiede una lente soffice e facilmente deformabile, molto idratata.

Tra gli uccelli, il pollo domestico è stato studiato in modo più dettagliato: nei Galliformi la cristallina  rappresenta più del 50% delle cristalline ed è nettamente separata dalle altre cristalline in quanto non possiede residui di cisteina, bensì leucina in abbondanza e un elevato contenuto di a elica. Sempre nel pollo, la cristallina d è stata quella più studiata: è la prima ad essere presente nel cristallino dell’embrione di 4 giorni, per crescere progressivamente fino a raggiungere un plateau al 19° giorno, mentre dopo la nascita la sua sintesi diminuisce, tant’è che tra il 3° e il 5° mese di vita l’mRNA per la cristallina d scompare dalle cellule delle fibre. A causa della sequenza temporale della sua sintesi, la maggior parte della cristallina d si trova concentrata nel nucleo della lente.

È stato dimostrato che la cristallina d è presente in due forme non alleliche. Le sequenze dei due geni d1 e d2 sono altamente omologhe - circa 90% di omologia - e sono disposte in tandem sul cromosoma, separate da 4 kb di sequenza intergenica. Ambedue i geni posseggono 17 exoni e 16 introni e, in seguito alla conoscenza di queste raffinatezze, è possibile esaminare in dettaglio il controllo della loro espressione.

L’RNA messaggero isolato dalla lente del pollo domestico sembra contenere l’mRNA per la d1 ma non per la d2, suggerendo così che il primo gene dev’essere molto più attivo del secondo. Anche l’anatra ha due geni simili per la cristallina d, per cui si può pensare che la duplicazione del gene si sia verificata prima della divergenza delle specie aviarie.

La cristallina a è l’ultima ad essere sintetizzata durante la vita embrionale del pollo e il gene che ne è responsabile è composto da 3 exoni e da 2 introni.

Un riscontro inaspettato circa la struttura delle cristalline è la loro relazione con le altre proteine. La cristallina a somiglia moltissimo a un gruppo di proteine note col nome di proteine da shock di calore, che possono avere un certo numero di funzioni in seno alla cellula. La superfamiglia delle cristalline b e g è simile alla proteina del mantello della spora batterica legante il calcio, ma la relazione più sorprendente è forse quella che le cristalline hanno con certi enzimi metabolici, tra i quali possiamo annoverare l’ASL (argininsuccinatolisasi), la lattato deidrogenasi, la glutatione S-trasferasi e varie reduttasi NADPH [1] dipendenti. Queste somiglianze suggeriscono la possibilità che lo stesso gene codifichi ambedue le funzioni, quella della lente e quella metabolica.

La cristallina d del pollo domestico e l’enzima ASL, importante nel ciclo dell’urea, sono molto simili, e quella dell’anatra ha un’elevata attività ASL, mentre quella del pollo è modesta. Piatigorsky (1988) ha dimostrato che il cDNA della cristallina d1 del pollo e il DNA genomico umano si ibridano con il gene dell’ASL umana (da notare che i mammiferi, uomo incluso, non hanno la cristallina d). Questi dati  insieme ad altri, che non è il caso di citare, sulla somiglianza tra le cristalline e le altre proteine non correlate dal punto di vista funzionale, suggeriscono l’ipotesi secondo cui esse sono derivate da un processo di evoluzione divergente.

Le cristalline si sono evolute molto lentamente, con un cambiamento di sequenza pari a solo il 3% in 10⁸ anni. Questo fatto, come già accennato, può essere in parte giustificato da un’elevata pressione selettiva, cioè una selezione per due tipi distinti di lenti e di funzioni enzimatiche. Il tutto è particolarmente interessante in relazione alla teoria neutralista dell’evoluzione e della deriva genetica casuale. Una deriva casuale sembrerebbe meno probabile se i geni si evolvono in vista di funzioni molteplici.

5.3.c. Proteine contrattili

Nei processi di contrazione sono coinvolte direttamente o indirettamente alcune proteine, presenti nelle fibre muscolari o in altre cellule dell’organismo. Nel secondo caso hanno il ruolo di mantenere o di variare la forma della cellula, nonché di formare il fuso durante la mitosi. Si pensa che la maggioranza delle proteine contrattili del muscolo possano essersi evolute dagli stessi tipi ancestrali come è accaduto per quelle presenti nel citoscheletro degli altri tipi cellulari.

Actina

L’a actina è presente solo nelle cellule muscolari, mentre b actina e g actina si riscontrano in tutte le cellule dell’organismo. Tutti e tre i tipi sono stati sequenziati, e l’a actina differisce dalle altre due nella sequenza dell’estremità N e per il fatto di avere un punto isoelettrico minore.

In seno ai tipi base esistono tuttavia delle eterogeneità, tant’è che nel pollo domestico esistono almeno 6 tipi di actina e non si può escludere l’esistenza di ulteriori componenti minori. Queste 6 forme includono tre tipi di a actina e due di g actina. Le prime sono state sottoposte a sequenziamento e si è visto che esistono scarse differenze tra quelle del muscolo cardiaco, della muscolatura scheletrica e della muscolatura liscia. Possiamo aggiungere che la g actina del ventriglio del pollo domestico è diversa da quella delle cellule non muscolari.

Pertanto, analizzando il DNA deputato alla sintesi dell’actina, dovremmo aspettarci di trovare almeno 6 geni. I risultati ottenuti mediante tecniche di ibridazione del cDNA, a sua volta derivato dall’mRNA, dimostrano che esistono 10-11 copie di geni per genoma.

Mentre gli elementi promotori sono fondamentali per determinare se la trascrizione debba avvenire oppure no, gli enhancers, o elementi di intensificazione, sono necessari per ottenere il massimo grado di trascrizione per un determinato gene. Un enhancer ha una funzione di aiuto nel controllo della trascrizione esercitato dal promotore al quale è legato, anche se può trovarsi a parecchia distanza, talora ad oltre 1.000 bp. Nelle cellule animali gli enhancers sono in grado di attivare i geni sia che si trovino a monte, sia che si trovino a valle del punto d’inizio dell’RNA e anche quando si trovano all’interno della sequenza codificante. Nel lievito ci sono tre elementi funzionalmente simili agli enhancers, detti sequenze attivatrici a monte, upstream activator sequences o UAS, le quali, come gli enhancers possono funzionare in entrambi gli orientamenti e a distanza variabile dal promotore.

Al fine di poter studiare la regione regolatrice, o regione del promoter, dei geni strutturali dei vari tipi di actina, furono inseriti frammenti della sequenza attivatrice a monte in un vettore, riuscendo così a dedurre quante UAS appartenenti al gene strutturale sono necessarie per la sua espressione e qual è l’entità della potenza del promotore. Un promotore forte è in grado di rendere il gene strutturale capace di esprimersi più frequentemente, per cui nella cellula troveremo una maggior quantità di prodotti derivati da tale gene. Il promoter della b actina è quello più potente e ciò concorda col riscontro dell’abbondanza di b actina in parecchi tipi cellulari.

Miosina

La miosina è una molecola lunga 150 nm spessa circa 3 nm, è la proteina più abbondante del muscolo scheletrico, esamero con peso molecolare totale di 500.000 Da, composto da due catene pesanti, ciascuna con peso molecolare 200.000 e da due paia di catene leggere con peso molecolare pari a 20.000 Da per ciascuna catena.

Due catene leggere, LC1 e LC3, sono state sequenziate e si è visto che la disposizione dei relativi geni è piuttosto inabituale: un singolo gene composto da 9 exoni e da 8 introni codifica per ambedue le proteine. Gli exoni 1-4-5-6-7-8-9 codificano per l’mRNA di LC1 mentre gli exoni 2-3-5-6-7-8-9 codificano per l’mRNA di LC3.

Troponine

Dal muscolo scheletrico del pollo domestico è stato clonato e sequenziato un terzo gene, quello per la troponina I. La troponina fa parte del sistema di regolazione del muscolo scheletrico, forse impedendo lo scorrimento delle teste miosiniche nelle docce actiniche. Tutte le sequenze geniche relative alle varie troponine mostrano un’estesa omologia, per cui si pensa che l’espressione dello sviluppo delle proteine muscolari debba sottostare a un controllo coordinato.

Tubuline

Le tubuline sono proteine che fanno parte del citoscheletro, deputate alla formazione del fuso mitotico e meiotico nonché al processo di allungamento delle cellule nervose. Insieme alle actine determinano le modificazioni di forma della cellula eucariotica. Due tipi distanti di monomeri, a tubulina e b tubulina, costituiscono un eterodimero che a sua volta si polimerizza per dar luogo ai microtubuli che percorrono da un capo all’altro la cellula eucariotica. La maggioranza dei lavori concernenti le tubuline sono stati compiuti sull’embrione di pollo, precisamente sul tessuto cerebrale. Gli ultimi dati indicano che nel pollo domestico i geni delle tubuline sono dispersi su vari cromosomi, e che esiste una famiglia per la b tubulina costituita da 7 geni, attualmente tutti sequenziati, e di essi almeno due si trovano sul cromosoma 2. Alcuni si esprimono di preferenza in alcuni tessuti nel modo seguente:

o   b-1 nel muscolo scheletrico

o   b-2 nel cervello

o   b-3 prevalentemente nel testicolo, ma anche in altri tessuti

o   b-4 nei neuroni

o   b-5 in piccola quantità nella maggior parte delle cellule, assente nei neuroni

o   b-6 nei microtubuli delle cellule emopoietiche

o   b-7 nella maggior parte delle cellule

Ognuno dei geni per queste b tubuline ha un’unica modalità di espressione durante lo sviluppo.

I geni dell’a tubulina si trovano dispersi su 4 differenti cromosomi, e di essi uno si trova sul cromosoma 1 e un altro sul cromosoma 8. Per ora sono state descritte almeno 7 diverse a tubuline. Siccome il numero delle isoforme sembra maggiore del numero dei geni, si pensa che alcune forme siano il risultato di modificazioni post traduzionali.

5.3.d. Collageni

Il collagene è la proteina più abbondante dell’organismo in quanto è virtualmente presente in tutti i tessuti. Come dice la parola, il collagene ha la funzione di incollare, di determinare una coesione tra i vari componenti di un tessuto. Fa eccezione il sangue, in cui la sostanza collagene è assente, in quanto si tratta di un tessuto con matrice intercellulare liquida, e ciò al fine di poter circolare liberamente nei vasi sanguigni.

Il collagene, insolubile, viene sintetizzato nelle cellule sotto forma di precursore, il procollagene, che è solubile. Viene poi secreto e modificato al fine di generare la matrice intercellulare. Esistono vari tipi di collagene, differenti in base alla grandezza delle unità che vengono polimerizzate e alla disposizione spaziale di ogni unità in seno alla matrice.

Le forme tipiche hanno una disposizione a elica tripla delle catene polipeptidiche che compongono circa il 90% della struttura totale. La glicina è presente ogni 3 residui aminoacidici, e tra gli aminoacidi più frequenti troviamo prolina, alanina e serina. I tipi differenti di collagene sono numerati in romano da I a X. Il tipo I è il più abbondante (90%). Esistono due geni deputati alla sintesi dei suoi due precursori, il procollagene a1 e a2. Nel pollo domestico il collagene di tipo I è stato quello più studiato e i geni dei suoi due precursori sono stati ambedue clonati. Anche il tipo VI è stato clonato nel pollo.

Si suppone che il collagene provenga da una sequenza primordiale di 9 bp che si è triplicata in 27 bp e che quindi si è condensata in 54 bp. La sequenza di 9 bp corrisponderebbe alla sequenza ripetitiva di aminoacidi presente nella tripla elica. Il residuo di glicina in ogni terza posizione dell’elica tripla è essenziale per garantire stabilità alla molecola, e ciò necessita di un meccanismo preciso nella reazione di escissione degli introni. Nonostante la pro-a1(I) e la pro-a2(I) siano polipeptidi coespressi ed interdipendenti, essi differiscono in modo sostanziale per la loro sequenza aminoacidica dovuta alle differenze circa la posizione del terzo codone che per pro-a2(I) è U, sostituito da C in pro-a1(I).

5.3.e. Cheratina

La cheratina è il principale prodotto genico dei tessuti epidermici. È la proteina predominante dei peli, dei capelli, della lana, delle piume, degli artigli, delle unghie e del becco, per cui riveste grande importanza negli uccelli.

Le b cheratine presenti nelle piume comprendono almeno 20 proteine differenti, prodotte da una famiglia multigenica. Presland (1989) ha clonato e sequenziato 4 di questi geni, dotati di un alto grado di somiglianza, e che si esprimono nel tessuto della piuma a partire dal 14° giorno di vita embrionale. Successivamente è stato clonato un grappolo di 18 geni per la cheratina delle piume, affiancato da ciascun lato da altri geni per la cheratina, inclusa quella delle squame.

5.3.e. Proteine dell’uovo

Proteine dell’albume

Esistono degli aspetti particolarmente interessanti connessi alla clonazione e al sequenziamento delle proteine dell’albume:

q   queste proteine sono in maggioranza sintetizzate dalle cellule delle ghiandole tubulari dell’ovidutto e si trovano tutte sotto controllo ormonale

q   la struttura delle proteine più importanti è stata analizzata da cima a fondo.

I geni finora studiati sono quelli per l’ovalbumina, l’ovotransferrina (o conalbumina), l’ovomucoide, il lisozima e l’avidina. Nonostante la loro sintesi sia sotto controllo ormonale, la risposta è variabile a seconda della proteina.

L’estradiolo causa un rapido incremento dell’mRNA per l’ovotransferrina, mentre l’incremento per quello dell’ovalbumina è un po’ ritardato. Questo fatto può essere legato al differente fiancheggiamento delle sequenze in quei geni che interessano l’efficienza del promotore. Comunque, i geni contengono degli introni il cui numero è irregolarmente proporzionale alle dimensioni della proteina. Per fare due esempi, il lisozima e l’ovotransferrina, con peso molecolare rispettivamente pari a 14.300 e a 80.000 Da, hanno i rispettivi geni contenenti 4 e 17 exoni.

Due geni, X e Y, strettamente correlati al gene deputato alla sintesi dell’ovalbumina, sono anch’essi sotto il controllo degli ormoni steroidei. I geni X e Y, insieme al gene dell’ovalbumina, sono contenuti in un frammento di DNA di 46 kb e si pensa che siano derivati da duplicazione genica. Ognuno di essi è composto da 8 exoni che differiscono solo per le dimensioni della regione non tradotta. Ambedue sono espressi nella gallina in fase depositiva, ma ad un livello più basso rispetto all’espressione del gene per l’ovalbumina, in quanto il loro mRNA è pari solo al 2% dell’mRNA per l’ovalbumina. In vitro, l’mRNA dei geni X e Y è stato tradotto e le proteine derivanti sono distinte dall’ovalbumina.

La sequenza completa del gene per l’ovalbumina rivela quanto sia abbondante la quota di introni paragonata con le aree codificanti: in totale si tratta di 7.564 b (basi), delle quali solo 1.872 rappresentano la sequenza codificante. Il gene per l’ovomucoide è composto da 5,6 kb mentre la zona codificante contiene solo 812 b. Si pensa che il gene per l’ovomucoide sia derivato da un processo di duplicazione genica, dal momento che è costituito da 3 dominî simili. La regione codificante di ognuno di questi dominî è separata da un introne. Tuttavia esistono 7 introni, e l’exone più breve è di sole 20 b. Per i geni finora sequenziati, si è visto che le dimensioni delle aree degli introni sono maggiori  rispetto a quelle degli exoni.

Proteine del tuorlo

Le vitellogenine costituiscono la famiglia maggiore dei precursori delle proteine del tuorlo e vengono sintetizzate nel fegato in risposta allo stimolo estrogenico. Si tratta di proteine di grandi dimensioni, circa 200.000 Da, immagazzinate in modo selettivo dall’oocita di gallina in via di sviluppo, per essere successivamente scisse in lipovitellina e fosvitina, accumulate nel tuorlo sotto forma di granuli che serviranno a nutrire l’embrione in via di sviluppo. Esistono 3 geni separati che codificano per le vitellogenine e sono stati isolati 3 distinti polipeptidi, siglati VtgI, VtgII e VtgIII, dei quali VtgII è il più abbondante. È stata determinata la sequenza completa del gene per VtgII, composto da 20.342 bp che comprendono 35 exoni. Anche il gene per la VtgIII è stato clonato e sia il gene per VtgII che quello per VtgIII sono fiancheggiati da pseudogèni, YVtgII adiacente a VtgII e YVtgIII adiacente a VtgIII.

5.3.g. Istoni e protamine

Istoni

Gli istoni sono le proteine responsabili della disposizione compatta del DNA in seno al cromosoma. Nelle cellule a rapida suddivisione la sintesi del DNA si verifica durante la fase S, accompagnata da una sintesi parallela di istoni che sono proteine altamente conservate.

I geni responsabili degli istoni sono stati quelli più precocemente studiati a livello molecolare, e uno dei motivi consiste nel fatto che nel nucleo di certi organismi esistono parecchie copie di geni per gli istoni, rendendo l’analisi più facile. Le copie possono essere 1.600 come nell’axolotl, oppure solamente due come nel lievito. Si pensa che l’elevato numero di copie di geni per gli istoni permetta una rapida divisione cellulare, come è richiesta nel caso dello sviluppo embrionale, nonostante l’adulto conservi tale abbondante dotazione. Nel pollo esistono circa 10 copie di ogni gene per gli istoni. Tutte queste copie multiple di un gene possono trovarsi disposte in vario modo: a grappolo ripetuto in tandem, disperse in seno ai vari cromosomi, raggruppate in piccoli grappoli. Studi recenti hanno messo in chiaro che nel pollo si trovano raggruppati in grappoli casuali e non sono ripetuti in tandem.

Uno degli aspetti più particolari dell’organizzazione dei geni per gli istoni è il fatto che, rispetto agli altri geni degli eucarioti, mancano generalmente di introni. Una variante dell’istone H2A, nota come H2AF, è stata sottoposta a sequenziamento nel pollo domestico e si è visto, invece, che contiene 4 introni, come accade anche per la variante H3.3 sempre del pollo. Un’altra caratteristica che queste due varianti condividono con l’istone H5 è il fatto che la loro espressione è indipendente dal ciclo cellulare, mentre gran parte della sintesi degli istoni è strettamente accoppiata alla sintesi del DNA che si verifica nella fase S del ciclo.

Protamine

Durante la spermatogenesi si verifica una drastico cambiamento della struttura della cromatina e gli istoni del core del nucleosoma vengono completamente sostituiti da un altro gruppo di proteine basiche note come protamine. Le protamine determinano la compattazione della cromatina nucleare, sono proteine più piccole degli istoni, con peso molecolare per lo più pari a 4.000÷7.000, contenenti un’elevata quantità di arginina che è un aminoacido basico. Nel pollo domestico sono presenti 2 loci per la protamina, detta gallina [2] . Ambedue i loci hanno regioni codificanti identiche e il numero di copie dei geni assomma a due per ogni genoma aploide, cioè una copia per ciascun locus. A differenza di quanto accade nei mammiferi che posseggono un introne per locus, nel pollo nessuno dei due loci contiene introni, condividendo questa caratteristica coi salmonidi, il cui significato evoluzionistico è ancora oggetto di discussione e di indagine.

Dall’insieme dei dati attualmente a nostra disposizione possiamo trarre le seguenti considerazioni generali:

§ gli introni hanno generalmente dimensioni estese, occupando spesso più della metà del gene

§ si verifica una maggior conservazione della sequenza nucleotidica degli exoni rispetto a quella degli introni

§ i geni che codificano per proteine piccole, tipo gli istoni, mancano di introni

§ i geni che sono tra loro correlati sono frequentemente, se non sempre, raggruppati sui cromosomi; esempi di questi raggruppamenti sono forniti dai geni per le ovalbumine, gli istoni, le d cristalline, le immunoglobuline

§ le sequenze promoter sono importanti nella regolazione dell’espressione genica durante lo sviluppo.