Vol. 2° -  XVIII.2.5.

Tecnica Southern blot

Il blotting rappresenta una metodica per eseguire l’ibridazione di frammenti di acidi nucleici con una sonda o probe. Presuppone che l’acido nucleico da analizzare sia già stato frammentato da enzimi di restrizione, clonato e amplificato, ad esempio con la PCR, e separato nelle frazioni costituenti impiegando l’elettroforesi.

In inglese blot significa asciugare con carta assorbente, e fa riferimento alla fase finale della metodica, quando viene impiegata una pila di carta da filtro asciutta. In questa tecnica cromatografica [1] ideata da Southern (1975) la miscela di frammenti è sottoposta a elettroforesi su gel di agar [2] , cui segue una denaturazione per ottenere frammenti a un solo filamento.

Questi sono poi trasferiti, o assorbiti, su un filtro di nitrocellulosa sul quale restano immobilizzati nelle relative posizioni. Successivamente vengono aggiunte sonde geniche specifiche marcate con radioisotopi che si ibridano coi frammenti complementari presenti sul filtro, successivamente rivelati da un’autoradiografia [3] .

Una tecnica simile, impiegata per determinare i frammenti di RNA, è detta per analogia Northern blot.

 sommario 

 avanti 


[1] Cromatografia: si tratta di una tecnica per l’analisi o la separazione di miscele di gas, liquidi o sostanze in soluzione. Nella tecnica originale inventata da un russo di origine italiana, Michail Tswett (1872-1919), denominata cromatografia su colonna, un tubo verticale di vetro è riempito con un materiale adsorbente (per esempio allumina) e il campione in esame viene fatto scendere nella colonna e trascinato da un solvente aggiunto in continuo (eluizione). I vari componenti della miscela vengono adsorbiti in misura differente e, di conseguenza, scendono lungo la colonna con velocità diversa.

[2] Agar o agar-agar è parola malese usata per un tipo di alga piuttosto comune in quell’area dell’Asia. In biologia indica un gel, miscela complessa di diversi tipi di zuccheri, a sua volta derivato da una miscela di alghe rosse, come lo sono numerose specie del genere Gelidium. Tale composto è usato come agente gelificante per terreni e brodi di coltura microbiologici, per uso alimentare, farmaceutico (componente di alcuni lassativi), nonché cosmetico.

[3] Autoradiografia: tecnica sperimentale in cui un campione radioattivo viene messo a contatto o in vicinanza di una lastra fotografica, in modo tale da produrre una mappa della distribuzione della radioattività del campione, in quanto la lastra viene impressionata dalle radiazioni ionizzanti emesse dalle aree radioattive. L’autoradiografia viene impiegata nello studio della distribuzione di particolari sostanze nei tessuti e nelle cellule. A questo scopo vengono preventivamente introdotte nell’organismo sostanze marcate con isotopi radioattivi.