Vol. 2° -  XVIII.2.2.

I vettori di espressione

Per poter applicare le metodologie di ingegneria genetica si rende spesso necessario disporre di elevate quantità di DNA. I campioni che normalmente vengono ottenuti dai prelievi (sangue, liquido seminale etc) sono spesso insufficienti. Diventa quindi indispensabile un passo preliminare consistente nell’amplificazione del materiale genico di cui si dispone, che viene integrato in vettori, ovvero segmenti di DNA capaci di replicazione autonoma

Un plasmide è una struttura extracromosomica della cellula costituita da DNA capace di resistere e di replicarsi indipendentemente dai cromosomi. Nelle cellule batteriche i plasmidi forniscono le informazioni genetiche necessarie per alcune attività cellulari, come per esempio la resistenza agli antibiotici, e nelle colonie batteriche possono essere trasferiti da una cellula all’altra. L’integrazione del tratto di DNA nel plasmide, dopo aver tagliato entrambi con il medesimo enzima di restrizione in grado di originare delle sticky ends, avviene per le leggi della complementarietà. Una volta inserito il campione, questo si duplica insieme al plasmide stesso.

Fig. XVIII. 1 – Cellula di Escherichia coli con cromosoma e plasmide

Nelle cellule di parecchie specie, uomo compreso, sono stati identificati agglomerati di DNA simili ai plasmidi che sembrano muoversi da un cromosoma all’altro. Negli organismi diversi dall’uomo finora studiati, questi agglomerati sembrano interferire con l’attività genica, come accade coi trasposoni. Nell’uomo questa connessione non è ancora stata stabilita, nonostante questi agglomerati di DNA siano quasi identici ai retrovirus che sicuramente influiscono sull’attività dei geni. Ricordiamo che i retrovirus sono degli RNA virus nei quali si verifica la conversione dell’RNA in DNA per mezzo della trascrittasi inversa per cui il DNA formato può venir integrato nel DNA della cellula ospite.

Se sarà la cellula di Escherichia coli a trasformarsi in un laboratorio, il vettore utilizzato sarà appunto un plasmide, elemento di DNA circolare che replica e si diffonde molto facilmente in seno alle colture del germe, trasmettendo alla progenie microbica la capacità di produrre la proteina codificata dal gene clonato.

I biotecnologi dispongono oggi di molti tipi di vettore. I più comuni sono derivati da plasmidi e da virus batteriofagi che condividono numerose caratteristiche essenziali. Uno dei vettori più conosciuti è il plasmide di Escherichia coli detto pBR322 (p = plasmide, BR = Bolivar & Rodriguez, coloro che hanno sviluppato questo plasmide). Di tale vettore è nota l’intera sequenza (4363 paia di basi nucleotidiche) e, conseguentemente, tutti i siti di restrizione sul quale potranno operare specifici enzimi, come spiegheremo tra poco in dettaglio. Un metodo comune di inserimento di DNA umano in tale plasmide consiste nell’inserire piccole code di poli-Citidina (DNA singola elica) per ibridizzarle con la coda di poli-G presente nel plasmide, dopo averlo linearizzato attraverso taglio enzimatico.

2.2.a. Il prodotto ricombinante

Lisando le cellule batteriche si possono ricavare grandi quantità del filamento originario. I plasmidi sono infatti facilmente separabili dai cromosomi batterici per le loro piccole dimensioni. Il DNA così ottenuto viene detto ricombinante in quanto costituito da un filamento batterico e uno di diversa origine, detto filamento originale.

Preparato e selezionato il clone del gene umano, per ottenere un prodotto in quantità elevata è necessaria una scelta rigorosa delle cellule eucariotiche o procariotiche a seconda del vettore prescelto e in base alle caratteristiche biologiche della molecola umana da sintetizzare.

Tra i procarioti il più utilizzato è sicuramente l’Escherichia coli; tra gli eucarioti il lievito di birra (Saccharomyces cerevisiae) oppure cellule di mammifero facilmente espandibili in coltura, come quelle di CHO, derivate dall’ovaio del criceto cinese.

Fig. XVIII.  2 – Tappe della clonazione di un frammento di DNA

Se la proteina da produrre richiede modificazioni post-traduzionali perché possa esplicare attività biologica (inserimento di glucidi, formazione di ponti disolfuro specifici, idrossilazione, acetilazione, forsforilazione etc) la sua produzione in procarioti può risultare molto ardua o addirittura impossibile. Per esempio, il tPA (attivatore tissutale del plasminogeno utilizzato per la lisi dei trombi) possiede normalmente ben 17 ponti disolfuro. Quando il gene che lo codifica è espresso in Escherichia coli, solo una piccola frazione della proteina svolge attività enzimatica, forse proprio in ragione della mancata formazione dei ponti S-S necessari perché la molecola assuma la conformazione tridimensionale che le permetta di funzionare biologicamente. Per cui un tPA attivo viene prodotto in lieviti; al contrario, l’interleuchina 2 prodotta in Escherichia coli ha un’attività equivalente a quella naturale, pur essendo priva dei glucosidi che la caratterizzano in natura [1] .