Vol. 2° -  XVIII.8.6.

YAC - Yeast Artificial Chromosomes

Gli YAC sono vettori di clonaggio molto utili per la costruzione di mappe fisiche ad alta risoluzione. Gli YAC permettono infatti di clonare larghe regioni di DNA (da 100Kb a più di 1.500Kb), risultando uno strumento utilissimo per ottenere contigui di una data regione cromosomica. Più che vettori veri e propri, gli YAC sono dei cromosomi artificiali inseriti in una cellula ospite di lievito. Per potersi replicare un cromosoma ha bisogno di strutture fondamentali:

o una o più origini di replicazione per permettere la duplicazione del DNA che contiene

o strutture terminali, dette telomeri, che assicurano la completa replicazione del DNA fino all'estremità di un cromosoma lineare.

Cromosomi privi di telomeri si accorciano leggermente ma costantemente ad ogni ciclo di replicazione cellulare e tendono a rompersi alle estremità per saldarsi ad altri cromosomi. Analizzando questi requisiti si è pensato di poter costruire un cromosoma condensato, ossia una molecola lineare contenente un’origine di replicazione, un centromero (necessario per la corretta segregazione dei cromosomi) e due telomeri agli estremi. Tale minicromosoma può replicarsi e restare come molecola lineare all'interno del nucleo di una cellula eucariotica.

Gli YAC sono inseriti in cellule di lievito poiché contengono le sequenze ARS (sequenze che si replicano autonomamente) di lievito. Tali cromosomi possono ospitare al loro interno frammenti di DNA grandi fino a 1Mb. Per le grandi dimensioni degli inserti clonati, un numero ridotto di cloni sarà necessario per coprire l'intero genoma. Nel sistema di mappatura, gli YAC ottenuti estraendo il DNA dalle cellule di lievito che li contengono non sono usati, a differenza di altri vettori come plasmidi e cosmidi, come sonde tal quali, poiché l'alto rapporto tra DNA di lievito e frammento di DNA clonato renderebbe necessario l'utilizzo di una elevata quantità di DNA per aumentare l'efficienza del sistema di mappatura.

Per superare questo limite gli YAC sono usati come sonde per esperimenti di FISH dopo essere stati amplificati con primer Alu, sequenze di 300pb distribuite una volta circa ogni 5Kb nel genoma umano, le quali permettono l'amplificazione specifica di sequenze inter-Alu umane dal DNA di lievito. L'amplificazione aumenta l'efficienza del segnale in esperimenti di FISH rispetto all'utilizzo della stessa sonda non amplificata. L'efficienza della generazione di sonde mediante Alu-PCR dipende dal numero delle sequenze Alu adeguatamente spaziate che fiancheggiano le sequenze sito specifiche in ciascuno YAC. Cloni YAC derivati da parti del genoma con un contenuto particolarmente basso in sequenze Alu daranno un segnale meno efficiente rispetto a cloni derivati da sequenze genomiche ricche di Alu.

Allo stesso scopo si può utilizzare una tecnica di separazione elettroforetica di lunghi frammenti di DNA, detta PFGE, che permette di separare i cromosomi artificiali di lievito da quelli naturali. Nella PFGE larghi frammenti di DNA ricavati dalla digestione di regioni genomiche possono essere separati su gel d'agarosio attraversato da un campo elettrico discontinuo.

Il principio su cui si basa questa tecnica è quello di far ruotare le molecole di DNA all'interno del gel in modo che anche molecole molto lunghe possano passare tra le maglie della matrice semisolida e migrare più o meno velocemente secondo la loro lunghezza. Si possono così separare frammenti di DNA lunghi da 50Kb a qualche Mb. Gli YAC sono molto usati in citogenetica come sonde specifiche di determinate regioni cromosomiche. Sono anche usati per isolare e caratterizzare regioni coinvolte in malattie genetiche o per caratterizzare punti di rottura sui cromosomi associati ad es. a trasformazioni neoplastiche. Per questo scopo è necessario conoscere la posizione fisica degli YAC e verificare che non siano chimerici.

Gli YAC chimerici sono YAC che contengono frammenti di DNA che ibridizzano su differenti regioni del genoma. Questo può essere dovuto o alla presenza di due frammenti diversi all'interno dello stesso clone o alla presenza di elementi ripetuti all'interno del genoma stesso. Per superare questi problemi si sta cercando di utilizzare tecniche sempre più raffinate come quella che permette di separare su gel di agarosio frammenti di DNA molto piccoli da grandi inserti in maniera da ridurre la possibilità di clonare insieme nello stesso YAC questi due tipi di frammenti.

Inoltre si sta cercando di creare una banca dati, completa anche di immagini, relativa a YAC dimostratisi non chimerici e omogeneamente distribuiti lungo il genoma. Per ottenere YAC di una data regione cromosomica, al fine di costruire un contiguo, si possono utilizzare dati sulla distribuzione degli STS lungo il genoma. Utilizzando sempre gli STS si possono ordinare gli YAC del contiguo. Due YAC che si sovrappongono mostreranno un comune STS, mentre YAC che contengono due o più STS potranno essere usati per estendere il contiguo.